Биочипы для решения задач диагностики туберкулеза - статьи - Каталог статей - Клинико - диагностическая лаборатория
Среда, 07.12.2016, 18:20
| RSS
Главная | Каталог статей
Меню сайта
Категории раздела
статьи [155]
Нормативные документы Украины [45]
Нормативные документы Казахстана [4]
Накази Мінпраці та соцполітики [3]
Патенты [68]
Нормативные документы Российской Федерации [34]
клінічні протоколи лікування хвороб [19]
авторефераты диссертаций [4]
Нормативные документы Беларуси [21]
Нормативные документы СССР [19]
Полезные ресурсы
Мир лаборатории
Медицинский форум
МедЛабДиагностика
Туберкулез предстательной железы
Каталоги
Яндекс цитирования Рейтинг@Mail.ru
Статистика
Клиническая лабораторная диагностика
Главная » Статьи » статьи

Биочипы для решения задач диагностики туберкулеза
Применение автоматизированных систем с использованием жидких сред – Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson) или BacT/Alert 3D (BioMerieux) – сокращает время обнаружения возбудителя до 2-3 нед. Определение чувствительности МБТ к ПТП первого ряда продлевает время анализа еще на 1-3 нед, и чаще всего больным назначают ПТП независимо от того, каким по лекарственной чувствительности штаммом они заражены, хотя подбор схемы лечения с учетом характера устойчивости МБТ у больного в значительной степени определяет ее эффективность.
Принципиальное решение проблемы быстрого обнаружения, идентификации возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности было найдено в результате разработки технологии биологических микрочипов.
Идея создания биологического микрочипа возникла еще в конце 1980-х гг. одновременно в Великобритании, Югославии и СССР. В Советском Союзе эти работы были инициированы и проводились под руководством выдающегося ученого, академика А.Д. Мирзабекова, который не боялся разрабатывать принципиально новые направления, даже когда результат было трудно предугадать. За свою жизнь А.Д. Мирзабеков трижды кардинально менял область своей деятельности, в каждой из которых он оставил глубокий след. В 1999 г. американская газета Sunday Times опубликовала список 20 ученых, работы которых окажут наибольшее влияние на развитие технологий ХХI века. Возглавлял этот список А.Д. Мирзабеков – «русский изобретатель первого в мире биочипа, который революционизирует медицинскую диагностику».
Технология биологических микрочипов была последним и любимым «детищем» Мирзабекова, когда он возглавлял Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и заведовал лабораторией биочипов. Суть этой технологии заключается в следующем.
Обычно для выявления или количественного анализа какого-либо вещества в окружающей среде или биологическом материале, полученном от пациента, проводят реакцию с реактивом, специфически взаимодействующим с этим веществом. В результате такой реакции образуется вещество с новыми физическими или химическими свойствами, количество которого определяют с помощью анализатора. В случае если образующееся вещество обладает цветом или может светиться под действием возбуждающего света, обнаружение и количественный анализ образовавшегося продукта определяют с помощью спектрофотометров или флуориметров. По количеству образовавшегося продукта судят о наличии и содержании в анализируемом образце того или иного вещества.
По такому же принципу работает и биологический микрочип. Он представляет собой твердую подложку с небольшими ячейками. В каждой ячейке иммобилизовано (закреплено) собственное вещество-реагент, которое служит зондом (щупом, пробой) для проведения той или иной реакции. Все реагенты расположены в определенном порядке и взаимодействуют с анализируемым образцом как ключи с замком. В том месте чипа, где есть соответствие (комплементарность) между молекулами исследуемого вещества и молекулами зонда, образуется новый продукт – дуплекс, который и определяется анализирующим оборудованием. Картина распределения ячеек биочипа, содержащих дуплексы, является индивидуальной характеристикой анализируемого образца.
Первые биологические микрочипы появились в конце прошлого века, а сейчас уже десятки компаний выпускают различные типы чипов, отличающиеся друг от друга по методике изготовления и методу, с помощью которого регистрируют результат взаимодействия чипа с образцом.
Существуют биочипы, изготавливаемые методом синтеза зондов непосредственно на подложке. Плотность ячеек в таком чипе очень высока: на площади 1 мм2 может быть расположено более тысячи ячеек, а весь чип содержит миллионы ячеек. Такие биочипы предназначены для анализа крупных фрагментов ДНК, иногда для анализа всего генома организма. Стоимость таких чипов, как и анализирующего оборудования, очень высока, и лишь очень богатые страны могут позволить себе проводить анализы с помощью этой технологии.
Принципиально другой тип чипов изготавливается путем нанесения раствора, содержащего зонд, на заранее подготовленную, «активированную» поверхность подложки. Такие «специализированные» чипы, имеющие гораздо меньшую плотность (на 1 мм2 расположены десятки ячеек), предназначены для работы с ограниченными фрагментами ДНК. Стоимость таких биочипов гораздо меньше.
По технологии, разработанной под руководством А.Д. Мирзабекова, зонды микрочипа расположены в ячейках, состоящих из геля. Объем каждой ячейки составляет примерно один нанолитр (миллионная доля литра). Биочип, содержащий трехмерные ячейки, обладает существенными преимуществами по сравнению со стандартными двумерными чипами. Взаимодействие исследуемых образцов с зондами, иммобилизованными в геле, имеет больше сходства с процессами, протекающими в растворе, чем в том случае, когда иммобилизованные зонды находятся на поверхности стекла, вследствие чего достигается высокая специфичность их взаимодействия с молекулами из анализируемого образца. Каждая ячейка содержит гораздо большее количество молекул зонда по сравнению с зондами, прикрепленными к двумерной поверхности. В водном окружении молекулы сохраняют свою активность, с ними можно проводить любую ферментативную реакцию. Трехмерные биочипы позволяют изучать кинетику и термодинамику реакций, протекающих в индивидуальных ячейках, в том числе образование дуплексов нуклеиновых кислот.
Каждая ячейка отделена от соседних ячеек гидрофобной поверхностью, что позволяет осуществлять в ячейках трехмерных биочипов разнообразные реакции, в т. ч. полимеразную цепную реакцию с различными праймерами и др.
В зависимости от того, какие молекулы содержится в ячейках биочипа и служат в качестве зондов, он может быть применен для разных целей. Если в ячейках содержатся фрагменты ДНК, идентичные тем, которые имеются в геноме возбудителей инфекционных болезней, биочип может быть использован для обнаружения и идентификации этих возбудителей. Так, уже разработаны биочипы для выявления возбудителей туберкулеза, неонатальных инфекций, оспы, гриппа, гепатита, герпеса, ряда др.
В качестве зондов можно использовать фрагменты ДНК с последовательностями, характерными при наследственных или обменных заболеваниях человека. В этом случае биочип может служить для обнаружения соответствующей болезни или для выявления предрасположенности к ней. Так, например, имеются чипы для выявления хромосомных мутаций при лейкозах, обнаружения предрасположенности к гипертонии и другим кардиологическим заболеваниям и т. д.
Поскольку молекулы сохраняют свою активность внутри ячеек биочипа, существует возможность создания белковых биочипов, содержащих в качестве зондов антигены или антитела. Такие биочипы могут применяться для проведения иммунохимических анализов, например для количественного анализа свободных и связанных специфических антител, онкомаркеров, биологических токсинов.
Еще одним важным достоинством трехмерных чипов является их высокая чувствительность, что позволяет использовать для регистрации результатов относительно простое оборудование и проводить сотни анализов в день. Эта технология предназначена для обследования больших групп населения с минимальными финансовыми затратами.
Результат взаимодействия биочипа с исследуемым образцом регистрируют анализатором биочипов по интенсивности флуоресценции красителя, присоединенного к анализируемому веществу. Специализированная компьютерная программа автоматически обнаруживает контрольные ячейки биочипа и определяет правильность проведения анализа. Затем эта же программа определяет интенсивность всех ячеек биочипа и детектирует, в каких из них произошло образование специфических дуплексов. На основании этих данных на мониторе компьютера появляется результат анализа в удобном для врача виде.
Совместные исследования ученых ИМБ РАН – разработчиков технологии биочипов – с сотрудниками Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения г. Москвы (МНПЦБТ) и Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН (ЦНИИТ), специалистами в области микробиологии и молекулярной диагностики туберкулеза привели к идее создания биочипа для обнаружения возбудителя туберкулеза и определения его чувствительности к рифампицину и изониазиду (одновременная устойчивость к этим двум препаратам определяется термином «множественная лекарственная устойчивость» – МЛУ).
В настоящее время известно, что резистентность МБТ к изониазиду определяется мутациями в четырех основных генах: katG, inhA, ahpC/oxyR, kasA, а также в менее изученных furA и ndh.
В более 95% случаев резистентность МБТ к рифампицину у больных туберкулезом обусловлена мутациями в коротком фрагменте (81 пара нуклеотидов) гена rpoB, кодирующего β-субъединицу РНК-полимеразы МБТ.
Работы по созданию такого биочипа были начаты в 1997 г. Разработанный биочип позволяет в течение суток обнаружить в образце, полученном от пациента, наличие возбудителя туберкулеза и выявить его лекарственную чувствительность. В 2004 г., после клинико-диагностических испытаний, проведенных в МНПЦБТ и ЦНИИТ, тест-система «ТБ-БИОЧИП» и прибор для обработки результатов анализа получили Государственную регистрацию в Федеральной службе РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.
«ТБ-БИОЧИП» представляет возможность параллельного выявления чувствительности МБТ к рифампицину и изониазиду с определением 29 типов мутаций по гену rpoB и 19 типов мутаций по генам katG, oxyR, inhA, обнаруживая не менее 95% рифампицин- и более 80% изониазидустойчивых штаммов. Более того, как показали исследования профессора И.Р. Дорожковой в МНПЦБТ, с помощью этой тестсистемы можно определять лекарственную чувствительность к рифампицину и изониазиду у L-форм Mycobacterium tuberculosis.
В настоящее время тест-систему «ТБ-БИОЧИП» успешно применяют в 12 противотуберкулезных центрах РФ, Южной Кореи, Кыргызстана, она проходит клинические испытания в США.
Таким образом, сегодня фтизиатры имеют уникальный инструмент для определения лекарственной чувствительности МБТ непосредственно после поступления больного туберкулезом в клинику, что позволяет немедленно начать направленную противотуберкулезную терапию и уменьшить риск внутрибольничного заражения туберкулезом. Эта же тест-система может быть использована для контроля эффективности применяемой терапии и своевременного обнаружения у пациента лекарственно устойчивых МБТ.
Учитывая важность быстрого определения чувствительности МБТ к фторхинолонам у больных с МЛУ-туберкулезом, по предложению МНПЦБТ в ИМБ недавно была разработана новая тест-система «ТБ-БИОЧИП-2», позволяющая определять 9 типов мутаций в QRDR области гена gyrA МБТ (регион резистентности к фторхинолонам), содержащей пять полиморфных кодонов (позиции 88, 90, 91, 94 и 95), обусловливающих развитие резистентности к фторхинолонам.
Результаты определения чувствительности МБТ к фторхинолонам, полученные с помощью «ТБ-БИОЧИП-2», их совпадение с данными культуральных исследований, а главное – быстрое получение ответа демонстрируют преимущество и перспективность данной тест-системы.
Таким образом, в настоящее время у врачей-фтизиатров появились две тест-системы: «ТБ-БИОЧИП» и «ТБ-БИОЧИП-2», которые позволяют оперативно определять чувствительность МБТ к основным ПТП первой и второй линий, что существенно не только для назначения адекватной и эффективной химиотерапии, но и контроля выявления устойчивости МБТ, возникающей в процессе лечения.
К тому же возможности разработки новых биочипов для идентификации микобактерий, контроля проводимого лечения далеко не исчерпаны. В связи с этим лабораторная диагностика туберкулеза стоит на пороге эры молекулярно-биологических методов, имеющих огромные перспективы.
Просмотров: 1677
Холодняк Любовь Владимировна
Хостинг от uCoz@Холодняк Любовь Владимировна