СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА - Патенты - Каталог статей - Клинико - диагностическая лаборатория
Суббота, 03.12.2016, 15:35
| RSS
Главная | Каталог статей
Меню сайта
Категории раздела
статьи [155]
Нормативные документы Украины [45]
Нормативные документы Казахстана [4]
Накази Мінпраці та соцполітики [3]
Патенты [68]
Нормативные документы Российской Федерации [34]
клінічні протоколи лікування хвороб [19]
авторефераты диссертаций [4]
Нормативные документы Беларуси [21]
Нормативные документы СССР [19]
Полезные ресурсы
Мир лаборатории
Медицинский форум
МедЛабДиагностика
Туберкулез предстательной железы
Каталоги
Яндекс цитирования Рейтинг@Mail.ru
Статистика
Клиническая лабораторная диагностика
Главная » Статьи » Патенты

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА
Номер патента: 2007714
Класс(ы) патента: G01N33/48
Номер заявки: 4899199/14
Дата подачи заявки: 03.01.1991
Дата публикации: 15.02.1994
Заявитель(и): Пермский государственный медицинский институт
Автор(ы): Быкова А.А.; Юшкова Т.А.; Гаришина М.Ф.
Патентообладатель(и): Пермский государственный медицинский институт
Суть изобретения: Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике рассеянного склероза (РС). Цель изобретения: повышение чувствительности, специфичности и точности способа диагностики РС, особенно дебюта, стертых и атипичных форм заболевания. С целью повышения чувствительности и специфичности способа лимфоциты крови больного, взятые до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1% -ного раствора серотонина соединяют в геле с эритроцитами барана, обработанными серотонином, выдерживают при температуре 37 - 37,5С в течение 60 - 90 мин и при постоянном числе зон лизиса эритроцитов 106-107 на 1 мл диагностируют рассеянный склероз. 4 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике рассеянного склероза (РС).
Известная иммунодиагностика РС основана на обнаружения в крови больных серологическими методами, а именно реакциями связывания комплемента, пассивной гемагглютинации, противомозговых, противотимоцитарных антител. Эти методы недостаточно чувствительны, так как дают по различным данным от 5 до 83% положительных результатов, причем нередки среди них ложноположительные. Кроме того, диагностика с их помощью осуществляется поздно - через несколько лет от начала заболевания.
Цель изобретения: повышение чувствительности, специфичности диагностики заболевания.
Предлагаемый способ диагностики основан на характерном только для больных РС свойстве их иммунной системы не реагировать на вводимый серотонин.
Новизна способа заключается в том, что лимфоциты крови больного РС, взятые до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1-ного раствора серотонина соединяют в геле с эритроцитами барана, обработанными серотонином, выдерживают при температуре 37-37,5оС в течение 60-90 мин и при постоянном числе зон лизиса эритроцитов 106-107/мл диагностируют рассеянный склероз.
Способ осуществляют следующим образом. Кровь забирают в пробирки с гепарином (50 ед/мл) и разводят средой 199, подкисленной КН2РО4 до цвета "чайной розы", при соотношении 1: 3. На 3 мл фиколл-верографина (24 ч 9% -ного фиколла и 10 ч 34% -ного верографина) наслаивают 8 мл разведенной крови и смесь центрифугируют 45 мин при 1500 об/мин. Взвесь лимфоцитов из интерфазы дважды путем центрифугирования в 5 мл среды 199 в течение 10 мин (1500 об/мин) отмывают от фиколл-верографина, затем ресуспендируют в 1 мл среды 199. Клетки подсчитывают в 3% -ном растворе уксусной кислоты с генциан-виолетом (0,05% ), после чего концентрацию клеток доводят средой 199 до 106 в 1 мл.
Бляшкообразующие лимфоциты среди клеток крови выявляют прямым пассивным локальным гемолизом в геле. В качестве геля используют агарозу. Готовят 0,75% -ный раствор агарозы на однократном растворе Хенкса, разогревая ее в колбе на кипящей водяной бане. Горячий раствор фильтруют через ватный фильтр и разливают в пробирки по 1 мл, помещают затем в ультратермостат при температуре 45оС. В качестве индикаторных эритроцитов используют эритроциты барана, обработанные хлористым хромом и нагруженные серотонином. При приготовлении индикаторных эритроцитов 0,2 мл 50% -ной взвеси тщательно отмытых нативных эритроцитов барана соединяют с 0,1 мл свежеприготовленного раствора хлорида хрома в концентрации 10 мг/мл и с 0,1 мл раствора серотонина в концентрации 20 мг/мл. Смесь выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре, затем дважды отмывают средой 199 и доводят той же средой до первоначального объема (0,2 мл). Эти эритроциты используют в реакции в концентрации 109 клеток на 10 мл агарозы. Суспензию лимфоцитов крови дважды отмывают раствором Хенкса, не содержащим ионы Са++ и М++. Конечная концентрация ядросодержащих клеток, используемая в реакции, составляла 106 клеток/мл. Поле приготовления суспензии эритроцитов и клеток крови помещают на 20 мин в ультратермостат при температуре 45оС. После того, как приготовлены все необходимые материалы для постановки реакции, достают из ультратермостата пробирку с агарозой и вносят в нее рабочие объемы эритроцитов барана и исследуемых лимфоидных клеток, быстро и тщательно перемешивают смесь. Эту смесь в объеме 1,5 мл разливают на горизонтальном столике в предварительно подогретые в термостате чашки "Орион" диаметром 5 см. Быстрым круговым движением распределяют слой агарозы по чашке. Для полного застывания агарозы чашки оставляют на горизонтальном столике на 15 мин, после чего инкубируют их в термостате при температуре 37-37,5оС в течение 60-90 мин. Через час, сняв крышки с чашек и дав агарозе чуть подсохнуть, наливают на слой агарозы в каждой чашке 1,5 мл раствора комплемента и вновь инкубируют чашки в течение часа при температуре 37оС. В качестве комплемента используют лиофилизированную сыворотку морской свинки производства ПНИИВС ("Сухой комплемент"). Содержимое ампулы (1 мл сухого комплемента) разводят в 5 мл среды 199, получая 20% -ный раствор, который используют в реакции. Учет реакции производят путем подсчета зон просветления ("бляшек") в проходящем свете, отмечая их с обратной стороны чашки карандашом "стеклограф". Число зон лизиса подсчитывают среди 106-107 жизнеспособных лимфоцитов.
Результаты исследований приведены в табл. 1-3.
П р и м е р 1. Больная З. , 37 лет, инвалид II группы, повторно поступила в клиническое отделение нервных болезней 1 февраля 1989 года с жалобами: слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, двоение, снижение зрения, периодическое нарушение функций тазовых органов. Из анамнезов известно, что больна с 1978 г. , течение заболевания ремиссирующее, обострения отмечались в 1982, 1985, 1987 г.
При осмотре отмечено: патологии со стороны внутренних органов нет. Р - 68 уд/мин. АД 120/80 мм рт. ст.
Неврологически: горизонтальный нистагм в обе стороны, речь дизартрична. Спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Выраженная статическая и динамическая атаксия.
Анализ мочи и крови без патологии.
На обзорной кардиограмме изменений нет. Глазное дно: декопорация височных половин дисков зрительных нервов.
Установлен диагноз: рассеянный склероз, цереброспинальная форма.
У больной до и через 30 мин после подкожного введения 0,5 мл 0,1% -ного раствора серотонина забрали кровь из пробирки с гепарином (50 ед/мл) и развели средой 199, подкисленной КН2РО4 до цвета "чайной розы" при соотношении 1: 3.
На 3 мл фиколл-верографина /24 ч 9% -ного фиколла и 10 ч 34% -ного верографина/ наслоили 8 мл разведенной крови и смесь процентрифугировали 45 мин при 400 (1500 об/мин). Взвесь лимфоцитов из интерфазы дважды путем центрифугирования в 5 мл среды 199 в течение 10 мин (1500 об/мин) отмывали от фиколл-верографина, затем ресуспендировали в 1 мл среды 199. Клетки подсчитали в 3% -ном растворе уксусной кислоты с генциан-виолетом (0,05% ), после чего концентрацию клеток довели средой 199 до 106 в 1 мл. Бляшкообразующие лимфоциты среди клеток крови выявляли прямым пассивным локальным гемолизом в геле. В качестве геля использовали агарозу. Готовили 0,75% -ный раствор агарозы на однократном растворе Хенкса, разогревая ее в колбе на кипящей водяной бане. Горячий раствор фильтровали через ватный фильтр и разливали в пробирки по 1 мл, затем помещали в ультратермостат при температуре 45оС. В качестве индикаторных эритроцитов использовали эритроциты барана, обработанные хлористым хромом и нагруженные серотонином. При приготовлении индикаторных эритроцитов 0,2 мл 50% -ной взвеси тщательно отмытых эритроцитов нативных соединяли с 0,1 мл свежеприготовленного раствора хлорида хрома в концентрации 1% мг/кг и с 0,1 мл раствора серотонина в концентрации 20 мг/кг. Смесь выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре, затем дважды отмывали средой 199 и доводили той же средой до первоначального объема (0,2 мл). Эти эритроциты использовали в реакции в концентрации 109 клеток на 10 мл агарозы. Суспензию лимфоцитов крови дважды отмывали раствором Хенкса, не содержащим ионов Са++ и М++. Конечная концентрация ядросодержащих клеток, используемая в реакции, составляла 106 клеток/мл. После приготовления суcпензии эритроцитов и клеток крови помещали на 20 мин в ультратермостат при температуре 45оС.
После того, как были приготовлены все необходимые материалы для постановки реакции, доставали из ультратермостата пробирку с агарозой и вносили в нее рабочие объемы эритроцитов барана и исследуемых лимфоидных клеток, быстро и тщательно перемешивали смесь. Эту смесь в объеме 1,5 мл разливали на горизонтальном столике в предварительно подогретые в термостате чашки "Орион" диаметром 5 см. Быстрым круговым движением распределяли слой агарозы по чашке. Для полного застывания агарозы чашки оставляли на горизонтальном столике на 15 мин, после чего инкубировали их в термостате при температуре 37оС в течение часа. Через час, сняв крышки и дав агарозе чуть подсохнуть, наливали на слой агарозы в каждой чашке 1,5 мл раствора комплемента и вновь инкубировали чашки в течение часа при температуре 37оС. В качестве комплемента использовали лиофилизированную сыворотку морской свинки производства ПНИИВС ("Сухой комплемент"). Содержимое ампулы (1 мл сухого комплемента) разводили в 5 мл среды 199, получая 20% -ный раствор, который использовали в реакции. Учет реакции производили путем подсчета зон просветления ("бляшек") в проходящем свете, отмечая их с обратной стороны чашки карандашом "стеклограф". Число зон лизиса подсчитывали среди 106 жизнеспособных лимфоцитов.
Число бляшек среди лимфоцитов крови больной в ответ на введение серотонина не изменилось (2 на 106 яск до 2,8 после введения серотонина). Подтвержден клинический диагноз рассеянного склероза.
П р и м е р 2. Больная Л. , 35 лет. Поступила в клинику 18 января 1989 г. с жалобами на слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, снижение зрения. Больна в течение полугода, когда стала отмечать нарастающую слабость в ногах, пошатывание. При осмотре патологии со стороны внутренних органов не выявлено. Р 76 уд. мин. АД 130 мм рт. ст. Неврологически: эйфория. Горизонтальный нистагм в обе стороны. Спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Интенциональный тремор с двух сторон. Не устойчива в позе Ромберга. На краниограмме патологии нет. Глазное дно без изменений. Установлен диагноз: дебют рассеянного склероза, цереброспинальная форма. Диагноз подтвержден иммунологическим исследованием крови, так как число бляшек, выявленных среди 106 лимфоцитов крови, составляло до введения серотонина 1,8, после введения 2,0. Эти данные позволили подтвердить клинический диагноз дебюта рассеянного склероза.
П р и м е р 3. Больная К. , 38 лет. Поступила в клинику неврологии 26 августа 1988 г. с жалобами на боли в пояснично-крестцовой области иррадиацией в левую ногу. При осмотре отмечено: сглажен поясничный лордоз, дефано мышц спины, положительный симптом Ласега справа, гипестезия по наружной поверхности правой голени. Правый ахиллов рефлекс не вызывается. На спондилограмме снижен диск между 4-5 поясничными позвонками, выраженный сколиоз.
Диагноз: остеохондроз пояснично-крестцового отдела позвоночника, грыжа диска, компрессия пятого поясничного корешка справа. У больной исследована кровь заявляемым способом.
Pезультат: число бляшек среди 106 лимфоцитов крови до введения серотонина 8,0, после введения 62,5. Заболевание рассеянным склерозом исключается абсолютно.
П р и м е р 4. Больная А. , 30 лет, практически здорова. Исследовали кровь описанным способом. У обследуемой выявлено среди 107 ядросодержащих клеток крови 4,0 бляшкообразующих лимфоцитов до и 60,0 после введения серотонина. Заболевание РС исключается абсолютно.
Результаты осуществления предлагаемого способа с использованием 107 на мл исследуемых лимфоцитов, 1010 эритроцитов, инкубации длительностью 90 мин при температуре 37оС, приведены в табл. 4. Результаты реализации предлагаемого способа с использованием 106 на мл исследуемых лимфоцитов, 109 эритроцитов, инкубации длительностью 60 мин при температуре 37оС, также приведены в табл. 4.
Преимущества способа заключаются в его высокой точности, специфичности, высокой чувствительности, возможности с его помощью осуществлять очень раннюю диагностику рассеянного склероза, еще до клинических проявлений заболевания, в том числе в детском возрасте, в возможности диагностики дебютов заболевания, стертых и атипичных его форм, поскольку диагностика основана на присущем всем больным РС и лицам с факторами риска, впервые установленном наследственном иммунодефиците - свойстве иммунной системы больных рассеянным склерозом не реагировать на вводимый в их организм серотонин. (56) Авторское свидетельство СССР N 1564546, кл. G 01 N 33/48, 1990.
Формула изобретения: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА путем исследования крови, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, лимфоциты крови больного, взятые до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1% -ного раствора серотонина, соединяют в геле с эритроцитами барана, обработанными серотонином, выдерживают при 37 - 37,5oС в течение 60 - 90 мин и при постоянном числе зон лизиса эритроцитов 106 - 107 на 1 мл диагностируют рассеянный склероз.
Просмотров: 833
Холодняк Любовь Владимировна
Хостинг от uCoz@Холодняк Любовь Владимировна