А. Б. Косырев, А. Б. Добровольский Современные методы лабораторного контроля антикоагулянтной терапии - статьи - Каталог статей - Клинико - диагностическая лаборатория
Четверг, 08.12.2016, 07:53
| RSS
Главная | Каталог статей
Меню сайта
Категории раздела
статьи [155]
Нормативные документы Украины [45]
Нормативные документы Казахстана [4]
Накази Мінпраці та соцполітики [3]
Патенты [68]
Нормативные документы Российской Федерации [34]
клінічні протоколи лікування хвороб [19]
авторефераты диссертаций [4]
Нормативные документы Беларуси [21]
Нормативные документы СССР [19]
Полезные ресурсы
Мир лаборатории
Медицинский форум
МедЛабДиагностика
Туберкулез предстательной железы
Каталоги
Яндекс цитирования Рейтинг@Mail.ru
Статистика
Клиническая лабораторная диагностика
Главная » Статьи » статьи

А. Б. Косырев, А. Б. Добровольский Современные методы лабораторного контроля антикоагулянтной терапии

 Современные методы лабораторного контроля антикоагулянтной терапии

А. Б. Косырев, А. Б. Добровольский. НИИ трансплантологии, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ

Проведение современной антикоагулянтной терапии невозможно без надлежащего лабораторного контроля за состоянием системы гемостаза. Методы, используемые в современной лабораторной практике для этого контроля, достаточно разнообразны и специфичны. Так, общепринятым тестом контроля терапии антикоагулянтами “непрямого” типа действия является протромбиновый тест. 

 Этот тест является одним из наиболее часто выполняемых коагулологических анализов, особенно в нашей стране. Он был предложен Quick A.J. et al. в 1935 г., и его часто называют по имени первого из авторов методики тестом Квика (Е-1). Принцип метода состоит в определении времени свертывания цитратной плазмы (в некоторых вариантах цельной крови) после добавления тромбопластина и Са2+. Хотя в названии теста, которое было дано задолго до выяснения основных реакций свертывания, присутствует имя только одного из факторов, в действительности результат теста зависит от:

1) содержания факторов VII, X, V, протромбина и фибриногена;

2) наличия патологических ингибиторов:

— полимеризации фибрина (ПДФ, миеломные белки);

— фосфолипид-зависимых реакций.

Техника выполнения протромбинового теста (ПТ) очень простая. Достаточно иметь термостат на 37°С, секундомер, пробирки и пипетки, а наличие простейшего коагулометра значительно уменьшает напряженность работы лаборанта и повышает производительность. Однако при очевидной простоте выполнения самого теста оценка его результатов представляет собой серьезную проблему, которая окончательно не решена до настоящего времени (Р-1). Две основные причины обуславливают сложность проблемы.

Во-первых, в тесте реализуется ряд последовательных и взаимовлияющих реакций, и суммарная скорость зависит от множества параметров. Во-вторых, тромбопластин представляет собой частично очищенный экстракт, который получают из тканей мозга, легких или плаценты разных млекопитающих, включая человека. Время свертывания нормальной и, что исключительно важно, патологической плазмы значительно варьирует в зависимости от источника и метода получения тромбопластина.

Для выражения результатов ПТ-теста используется:

1) время свертывания в секундах;

2) протромбиновое отношение (ПО), определяется как время свертывания плазмы больного/время свертывания нормальной плазмы

3) % протромбинового индекса (%-ПИ), определяются как время свертывания нормальной плазмы/время свертывания плазмы больного х 100 и величине присваивается размерность в процентном выражении;

4) процент от нормы;

5) международное нормализованное отношение (MHO).

Первые три системы выражения результатов ПТ-теста страдают серьезными недостатками, и от них следует отказаться. Время свертывания, ПО и %-ПИ свидетельствуют только о том, отличается ли плазма больного от нормальной, а информация о том, насколько они отличаются в действительности, скрыта от исследователя. На причинах этого мы остановимся позже.

По методу Квика для перевода времени свертывания в % протромбина строится калибровочный график. В основе его построения лежит простой логический принцип. Если содержание факторов протромбинового комплекса в нормальной плазме принять за 100%, то в разведенной в два раза оно будет 50%, в четыре — 25% и т. д. Мы исследовали влияние снижения концентрации факторов на время свертывания при определении с использованием четырех разных тромбопластинов. Было установлено, что тромбопластин может обладать “высокой” активностью* (~11 сек.), но плохо чувствовать снижение концентрации факторов, и “низкой” активностью (-23 сек.) при высокой чувствительности к дефициту факторов. Поэтому ни время свертывания, ни ПО и %-ПИ, представляющие собой время свертывания, умноженное или деленное на константу, не позволяют судить о том, насколько велика разница в содержании факторов. Другими словами, они являются некалиброванными величинами и поэтому не должны использоваться.

Проблема усложняется тем, что значения этих параметров варьируют не только между лабораториями, но и в пределах одной лаборатории при переходе от одной партии тромбопластина к другой, даже если они выпущены одним и тем же производителем.

В ПТ-тесте графики зависимости времени свертывания от концентрации факторов протромбинового комплекса имеют форму обратной функции (у = 1/х). Использование нелинейных графиков для перевода сек. в % протромбина не очень удобно. Поэтому для вычислений применяется линелизация графика в координатах 1 / % протромбина (т. е. 100%— 0.01; 50% — 0.02; 25%— 0.04; 12,5%— 0.08) от времени свертывания. Во многих современных коагулометрах используется именно этот подход и метод линейной регрессии для рассчета калибровочного графика и обратного перевода сек. в % протромбина по Квику. При такой оценке результатов нормальными принято считать значения протромбина >70%.

Недостатком этого метода калибровки ПТ-теста является то, что разведение плазмы моделирует только снижение концентрации факторов, которое может наблюдаться, например, при нарушении синтеза белков в печени. Однако при других патологиях (дефицит витамина К или прием его антагонистов — оральных антикоагулянтов) концентрация факторов может быть близкой к норме, но их функциональные свойства, определяющие взаимодействие и активацию факторов, существенно нарушены.

На практике это означает, что значения ПО, определенные с использованием разных тромбопластинов, могут быть приведены математически к одной величине, которая была бы получена при определении протромбина с неким стандартным тромбопластином. Эту величину было предложено называть MHO — международным нормализованным отношением (inr — английская аббревиатура).

Другой метод стандартизации ПТ-теста был принят ВОЗ в 1981 г. и модифицирован в 1983 г. (W-1). В его основе лежит установленное исследованиями по программам Международного комитета по стандартизации в гематологии и Международного комитета по тромбозу и гемостазу наличие линейной зависимости между логарифмами протромбинового времени, определенными с разными тромбопластинами, для плазм больных, находящихся в стабильной фазе терапии оральными антикоагулянтами.

Математической операцией, позволяющей перевести результаты ПТ-теста в один масштаб, является возведение ПО в степень, характеризующую чувствительность используемого препарата тромбопластина. Чувствительность первичного стандарта тромбопластина, зарегистрированного ВОЗ, была принята за 1,00, а всех последующих, включая национальные, должна вычисляться по отношению к этому стандарту тромбопластина. Введение системы MHO ознаменовало собой значительный прогресс в стандартизации ПТ-теста (v-2). Однако, несмотря на достижения, ряд проблем остался нерешенным. Одной из наиболее важных является влияние типа коагулометра на результат.

Коагулометры— приборы, предназначенные для автоматического определения времени, которое проходит от момента внесения в измерительную кювету стартового реактива до начала свертывания (образования первых нитей фибрина). Полимеризация фибрина сопровождается увеличением вязкости и светорассеивания (мутности). В зависимости от того, по какому из этих параметров определяется свертывание, коагулометры могут быть подразделены на механические и оптические. Более того, в пределах каждого из этих типов имеется значительное разнообразие конструкционных особенностей. Каждая из используемых систем имеет свои преимущества и свои недостатки, чем, по-видимому, и обусловлено наличие большого разнообразия конструкций. Различия в результатах измерений при использовании разных коагулометров обусловлены тем, что строго определить такое понятие, как “начало свертывания”, впрочем, как и его окончание, невозможно. Коагулометры запрограммированы на определение того отрезка времени, за который нарастание измеряемого параметра после внесения стартового реактива превысит определенный лимит. Способы “программирования” самые разнообразные: от соотношения между силой магнитного поля и размером/весом вращаемого шарика до определения порогового значения изменения оптической плотности, которое принимается за “начало свертывания”.

Следствием этого разнообразия является то, что значения времени свертывания, определенные с использованием одних и тех же плазм и реактивов, но разных коагулометров, могут не совпадать (Р-1). Хотя различия, обусловленные применением разных коагулометров, значительно меньше, чем те, которые вносит использование разных тромбопластинов, тем не менее они есть и их необходимо учитывать. С этой целью разработан и начинает применяться новый подход к стандартизации ПТ-теста, заключающийся в использовании набора калибровочных плазм для локальной стандартизации (v-1). Набор состоит из 4 лиофилизированных плазм: одной нормальной и трех, полученных от доноров, находящихся в стабильной фазе терапии оральными антикоагулянтами низкой, средней и высокой интенсивности. Важным преимуществом данного метода калибровки является также и то, что он менее трудоемкий, чем принятый ВОЗ в 1983 г. Кроме того, построение калибровочного графика по 4 плазмам уменьшает величину ошибки, обусловленной отклонением определенного в лаборатории значения времени свертывания нормальной плазмы от истинного. Вклад этой ошибки в конечный результат (вычисленное значение MHO) будет тем больше, чем ниже чувствительность (выше МИЧ) тромбопластина. Однако этот метод предложен относительно недавно, и только после проведения больших клинических исследований можно будет решить, какой из методов обеспечивает лучший контроль терапии.

По данным литературы, МИЧ для различных тромбопластинов, получаемых из экстрактов тканей, варьирует от 0.9 до 2.8. Чем выше значение МИЧ, тем менее чувствителен тромбопластин к изменению содержания компонентов протромбинового комплекса и, следовательно, тем больше может быть ошибка результата ПТ-теста. Тромбопластины с МИЧ > 2.0 лучше вообще не использовать, т. к. для достижения необходимой степени точности придется выполнять много параллельных определений одной пробы. Еще раз подчеркнем, что чувствительность тромбопластина и его “активность” — это разные и независимые величины.

Основная цель, которую преследовало введение MHO, состояла в обеспечении оптимизации терапии оральными антикоагулянтами. Использование единой системы контроля позволяет обобщать опыт, накопленный в разных клиниках, для подбора оптимального соотношения между риском развития тромбоза и кровотечения. Международный комитет по стандартизации в гематологии и Британское общество гематологов в 1984 г. рекомендовали MHO для терапии оральными антикоагулянтами в пределах от 2.0 до 4.5. Исследования, выполненные в последние годы, показали, что менее интенсивная антикоагуляция обеспечивает эффективную профилактику тромбозов при меньшем риске кровотечений, и в специальном докладе Американской ассоциации сердца, опубликованном в 1994 г., предложено при подборе дозы антикоагулянтов ориентироваться на терапевтические пределы MHO от 2.0 до 3.5. Анализ данных 8 проспективных рандомизированных исследований показал, что при правильно подобранной терапии антагонистами витамина К выигрыш в профилактике тромбозов значительно перекрывает риск кровотечений.

После того как были рассмотрены возможные способы представления результатов ПТ-теста, целесообразно еще раз вернуться к анализу общепринятого в нашей стране метода представления результатов в виде %-ПИ. Если представить, как могут соотноситься между собой % протромбина по Квику, ПО и %-ПИ при измерении с использованием 4 тромбопластинов разной чувствительности, то в норме (протромбин— 100%) все графики будут сходиться, но затем по мере движения в область патологии они должны значительно расходиться.

Путаница между % протромбина по Квику и %-ПИ привела к еще одному крайне неприятному результату. При составлении отечественной справочной литературы (Л-1, Ч-1) авторы учитывают и зарубежный опыт, что вполне логично. Но автоматический перенос рекомендаций по терапевтическим нормам, разработанным для % протромбина по Квику, на %-ПИ недопустим. Проиллюстрируем это следующим примером. Рекомендуемые терапевтические пределы 25— 40 %-ПИ при пересчете в протромбиновое отношение соответствуют 4.0— 2.5. Даже если лаборатория, в которой определяется протромбин, будет использовать для теста высокочувствительный тромбопластин с МИЧ = 1.0, то этим цифрам будет соответствовать MHO 2.5— 4.0, что хотя и близко, но все же выше, чем принято в настоящее время в мире. Если же будет использован тромбопластин средней чувствительности с МИЧ = 2, то указанные терапевтические пределы будут достигнуты при антикоагуляции соответствующей MHO 2.52 - 4.02 = 6.25— 16. Это уже чревато серьезными последствиями для больных. Для тромбопластина с МИЧ = 2.5 значение MHO составит 2.52.5-4.02.5= 9.9— 32 (!!!).

Безусловно, если известен индекс чувствительности используемого тромбопластина, то нормы MHO легко могут быть пересчитаны в %-ПИ. Такой обратный перевод, в принципе, можно было бы использовать для облегчения периода “перестройки”, но это вряд ли целесообразно.

Сложнее представляется проблема выбора между системой MHO и % протромбина по Квику. На наш взгляд, оправдано сохранение двух вариантов представления результатов ПТ-теста. Тем более, что для этого не потребуется ни выполнения двойного объема анализов, ни, соответственно, дополнительного расхода реактивов. Речь идет всего лишь об использовании двух способов расчета. В то же время применение двойной системы представления результатов позволит объединить преимущества каждой из них. Калибровка по Квику переводит результат теста в линейную шкалу, которая более привычна нам в повседневной жизни (но не в физиологии), и по которой легче ориентироваться в динамике факторов свертывания, а использование системы MHO обеспечит более надежный контроль интенсивности антикоагулянтной терапии.

В завершение анализа ПТ-теста остановимся на одной методической проблеме. Этот тест может выполняться с использованием как плазмы, полученной из венозной крови, так и капиллярной крови. Определение в капиллярной крови представляется привлекательным, т. к. не требует пункции вены. Однако при кажущейся простоте в действительности оно сопряжено с рядом проблем.

Первая и главная заключается в большей вероятности активации свертывания при сборе капиллярной крови. Кровь, проходя через поврежденную ткань, неизбежно контактирует с тромбогенной поверхностью и может активироваться. Это приводит вначале к “кажущемуся” увеличению содержания факторов (гиперкоагуляции), которое в действительности может быть лишь следствием их активации, а затем переходит в снижение содержания факторов (гипокоагуляцию), обусловленное низкой стабильностью активированных форм. Поэтому капиллярная кровь должна анализироваться как можно быстрее после взятия.

Вторая проблема связана с объемом крови, необходимой для анализа. В стандартном варианте постановки ПТ-теста используется 100 мкл плазмы и 200 мкл Са-тромбопластина. Быстро и аккуратно (без выдавливания из места прокола) собрать даже 100 мкл крови удается не всегда. Поэтому для ПТ-теста из капиллярной крови применяется реактив, содержащий кроме тромбопластина еще и плазму, из которой удалены факторы VII, Х и протромбин. Это обеспечивает возможность выполнения теста с использованием всего 20 мкл капиллярной крови, которая либо непосредственно вносится в 300 мкл реактива (при определении в присутствии больного), либо смешивается со 100 мкл буфера Оврена, содержащего цитрат, и доставляется в лабораторию для серийных исследований. Этот реактив может использоваться также и для определения протромбина в цитратной плазме. Преимущество постановки ПТ-теста с использованием малого объема плазмы больного и адсорбированной плазмы как источника фибриногена и фактора V, заключается в меньшей чувствительности этого метода к аномалиям фибриногена и ингибиторам полимеризации (табл. 4.1)

Таблица 4.1.

Контроль терапии оральными антикоагулянтами. Терапевтические области в виде MHO и соответствующие им значения %-ПИ, которые могли бы быть измерены при использовании тромбопластинов с МИЧ 1.0, 1.8 и 2.8.

 

% протромбинового индекса

MHO

МИЧ=1

МИЧ=1.8

МИЧ=2.8

Профилактика и лечение венозных тромбозов, ТЭЛА, инфарктов миокарда, тканевые протезы клапанов сердца

2.0-3.0

33-50

56-67

67-77

Больные высокого риска (повторные тромбоэмболии, механические клапаны сердца)

2.5 - 3.5

29-40

50-59

63-77

 

Наконец, третья проблема связана с влиянием гематокрита на результат теста. При внесении пипеткой в кювету стандартного объема цельной крови объем внесенной плазмы и, следовательно, концентрация факторов в реакционной смеси будет зависеть от величины гематокрита. При выражении результатов ПТ-теста в виде % протромбина по Квику влияние гематокрита может быть легко учтено путем умножения определенного по калибровке значения % от нормы на корректировочный фактор:

0,55 / 1- Hct (больного)

представляющий собой соотношение удельных объемов плазмы в норме и у анализируемого больного. Влияние гематокрита на ПО и его производные (%-ПИ и MHO) значительно сложнее и не может быть скорректировано с помощью простого фактора пересчета.

Несмотря на достаточно долгую историю применения различных форм гепарина для профилактики и лечения разнообразных клинических состояний, проблема лабораторного контроля за эффективностью его влияния на состояние системы гемостаза продолжает оставаться актуальной. Наиболее часто для этого контроля предлагается использовать два теста: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и тромбиновое время.

В основе теста АЧТВ лежит определение времени свертывания плазмы в присутствии активатора контактной фазы и фосфолипидов— частичного тромбопластина (аналога фосфолипидов тромбоцитов) после добавления СаС12. В качестве активатора контактной фазы ранее широко использовалась суспензия каолина. В последнее время предпочтение отдается эллаговой кислоте или микрочастицам окиси кремния. Эти реактивы не требуют постоянного перемешивания и “оптически прозрачные”, что позволяет использовать любые типы коагулометров. АЧТВ является тестом на “внутренний” путь активации свертывания и зависит от всех факторов за исключением VII и XIII. Его удлинение наблюдается при:

1) дефиците/аномалии факторов;

2) терапии гепарином и в меньшей степени антагонистами витамина К;

3) наличии патологических ингибиторов:

— полимеризации фибрина (ПДФ, миеломные белки);

— инактивирующих факторы.

Следует отметить, что в АЧТВ реализуется целый набор реакций, включающий прямые (последовательные), шунтирующие и взаимоускоряющиеся, которые в конечном счете приводят к резкому нарастанию образования тромбина и полимеризации фибрина. Поэтому заметное превышение величины АЧТВ по сравнению с верхней границей нормального распределения наблюдается лишь при выраженном снижении уровня факторов (как правило < 30% от нормы), и чувствительность к дефициту снижается по мере перехода от факторов, занимающих верхнее положение в системе реакций, к таковым конечных стадий.

Скорость процесса в таких сложных системах определяется в основном скоростью самой медленной реакции. В АЧТВ таковой является реципрокная активация тромбином фактора VIII, которая протекает в растворе и эффективно ингибируется комплексом ATIII-гепарин (Н-1). Это делает АЧТВ удобным методом лабораторного контроля интенсивности гепаринотерапии. Недостатком АЧТВ как метода контроля гепаринотерапии является зависимость этого теста от многих факторов, что при некоторых патологиях может приводить к несоответствию между истинной концентрацией гепарина в крови и ожидаемой исходя из данных АЧТВ. Например, в послеоперационном периоде и при активации воспалительных реакций повышение уровня фактора VIII и фибриногена, фибронектина, факторов системы комплемента и др. может уменьшать влияние гепарина на АЧТВ, а дефицит факторов и наличие аномальных антикоагулянтов усиливать его эффект. Очевидно, что влияние гепарина на эту систему зависит также и от уровня ATI II.

Удлинение АЧТВ при нормальном значении протромбинового времени может быть обусловлено дефицитом факторов XII, XI, IX, VIII, а также прекалликреина и ВМК, или наличием ингибиторов к этим факторам. Простейшим способом дифференцировки дефицита от присутствия ингибиторов является исследование коррекции АЧТВ после добавления к исследуемой плазме небольшого количества нормальной плазмы.

Серьезной и пока не решенной проблемой использования АЧТВ в диагностике является стандартизация теста. Очевидно, что стандартизовать тест, который определяет набор реакций и зависит, соответственно, от многих факторов, крайне сложно или, что вполне вероятно, невозможно. Реактивы, выпускаемые разными производителями, отличаются не только по разбросу значений, определяемых в норме, но и по чувствительности к ингибиторам и дефициту факторов. Лаборатории целесообразно подобрать в соответствии со специализацией наиболее подходящий реактив, который использовать в качестве основного, и иметь некоторое количество “специализированного” реактива, обладающего, например, повышенной чувствительностью к волчаночному антикоагулянту.

Тест тромбиновое время (ТВ) относится к числу скрининговых, и его необходимо определять, если результаты “глобальных” тестов превышают нормальные значения. В этом случае тест, определяющий время свертывания плазмы после добавления стандартного количества тромбина, может сузить диапазон поиска дефективного звена. Удлинение ТВ наблюдается при:

1) аномалии фибриногена (выраженная (< 0.3 г/л) гипофибриногенемия, дисфибриногенемии);

2) антикоагулянтной терапии гепарином или прямыми ингибиторами тромбина (гирудин, гирулог, синтетические ингибиторы), но не антагонистами витамина К;

3) наличии патологических ингибиторов полимеризации фибрина:

— продуктов деградации фибриногена/фибрина;

—аномальных антикоагулянтов (миеломных белков).

Нормальные значения ТВ зависят от активности тромбина. Для наиболее часто используемых растворов, содержащих 3 или б ME тромбина/мл, нормальные значения находятся в пределах 10— 13 и 17— 22 секунд, соответственно. Чем ниже концентрация тромбина, тем выше чувствительность теста к аномалиям. Этот тест обладает очень высокой чувствительностью к гепарину и при использовании реактива активностью в 17— 22 секунды ТВ выходит за пределы определения даже при терапии низкими дозами гепарина. В связи с этим для контроля гепаринотерапии более подходят реактивы высокой активности. На чувствительность теста к гепарину влияют также рН и состав буфера, используемого для стабилизации тромбина. Поэтому чувствительность к гепарину реактивов разных производителей может существенно различаться, даже в том случае, когда значения для нормальной плазмы совпадают.

В контроле гепаринотерапии АЧТВ и ТВ являются в большей степени взаимодополняющими, чем альтернативными тестами. Преимуществом ТВ является то, что на результат этого теста влияет меньшее число факторов, чем на АЧТВ. Он более специфичен, чем АЧТВ, отражает активность комплекса ATIII-гепарин в плазме. В то же время в АЧТВ контролируется влияние гепарина на активацию свертывания, что представляется более важным и могло бы быть аргументом в пользу бесспорного преимущества этого теста над ТВ. Однако активация свертывания и антикоагулянтный эффект гепарина в условиях АЧТВ так же, как и антикоагулянтный эффект гепарина в ТВ, существенно отличаются от таковых при тромбообразовании in vivo. Другими словами, корреляция между антикоагулянтными эффектами гепарина in vitro и антитромботической активностью in vivo пока оставляет желать лучшего. Диагностическая значимость этих тестов в контроле гепаринотерапии ограничивается информацией о приблизительном уровне циркулирующих в крови комплексов гепарина с АТ III, что может служить основанием для изменения, в соответствии с клиническими показаниями, режима гепаринотерапии.

Просмотров: 2104
Холодняк Любовь Владимировна
Хостинг от uCoz@Холодняк Любовь Владимировна