Обычные ОТ-ПЦР анализы генов, кодирующих матричный белок вирусов гриппа А (H1N1) - статьи - Каталог статей - Клинико - диагностическая лаборатория
Вторник, 06.12.2016, 14:06
| RSS
Главная | Каталог статей
Меню сайта
Категории раздела
статьи [155]
Нормативные документы Украины [45]
Нормативные документы Казахстана [4]
Накази Мінпраці та соцполітики [3]
Патенты [68]
Нормативные документы Российской Федерации [34]
клінічні протоколи лікування хвороб [19]
авторефераты диссертаций [4]
Нормативные документы Беларуси [21]
Нормативные документы СССР [19]
Полезные ресурсы
Мир лаборатории
Медицинский форум
МедЛабДиагностика
Туберкулез предстательной железы
Каталоги
Яндекс цитирования Рейтинг@Mail.ru
Статистика
Клиническая лабораторная диагностика
Главная » Статьи » статьи

Обычные ОТ-ПЦР анализы генов, кодирующих матричный белок вирусов гриппа А (H1N1)
Обычные ОТ-ПЦР анализы генов, кодирующих матричный белок вирусов гриппа А (H1N1) Протокол обычный ОТ-ПЦР Протоколы и праймеры для обычной ПЦР и гель-электрофореза продуктов с целью обнаружения вирусов гриппа типа А в образцах от людей приведены ниже. Данные протоколы показали себя достаточно эффективными для идентификации вирусов гриппа типа А, когда использовались с указанными реагентами и праймерами. Лабораториям, у которых имеются ограничения в отношении идентификации циркулирующих в настоящее время вирусов, рекомендуется связаться с одной из референс-лабораторий-ВОЗ по диагностике инфекции гриппа А/H5 или с одним из Сотрудничающих центров ВОЗ по гриппу для получения помощи от них в определении оптимальных для использования праймеров. Необходимые материалы • Мини набор «QIAamp® Viral RNA» (QIAGEN, Cat#52904. После надлежащей оценки могут использоваться другие наборы для выделения). • Набор One-Step RT-PCR (QIAGEN, Cat#210212) • Ингибитор РНКазы 20 ед/мкл (Applied Biosystems, Cat#8080119) • Без-РНКазная вода • Этанол (96-100%) • Микроцентрифуга (регулируемая до 13000 оборотов в минуту) • Регулируемые пипетки • Стерильные без-РНКазные наконечники для пипеток с аэрозольным фильтром • Вортекс • Пробирки для микроцентрифугрования (0.2, 1.5 мл.) • Термоциклер (ПЦР-аппарат) • Наборы праймеров • Положительный контроль (может быть получен по запросу, направленному в Сотрудничающий центр ВОЗ по гриппу, функционирующий на базе Центров по контролю и профилактике заболеваний - CDC, Атланта, США) Праймеры Ген: М Последовательности праймеров M30F2/08: 5`- ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG -3` M264R3/08: 5`- TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG -3` Ожидаемый размер продукта - 244 п.о. (ссылка: NIID ) Процедура 1. Выделите вирусную РНК из клинического образца посредством мини набора «QIAamp® Viral RNA» или эквивалентного ему набора для выделения РНК в соответствии с инструкцией производителя. 2. Выполните однораундовую ОТ-ПЦР • Достаньте реагенты из хранилища, нагрейте их до комнатной температуры. После того, как они оттаяли, храните их на льду • Приготовление мастер-микса (работайте на льду) • Добавьте следующие компоненты в пробирку для микроцентрифугирования и осторожно перемешайте, набирая мастер-микс в пипетку и высвобождая ее 10 раз (Замечание: для предотвращения локальных различий в концентрации солей, важно обеспечить полное перемешивание раствора перед использованием) Реакция без Q-раствора Вода (молекулярно-биологического качества ) 9,5 мкл 5х QIAGEN ОТ-ПЦР буфер 5,0 мкл дНТФ смесь 1,0 мкл Прямой праймер (10 мкмоль/л) 1,5 мкл Обратный праймер (10 мкмоль/л) 1,5 мкл Ферментная смесь 1,0 мкл Ингибитор РНКазы (20 ед/мкл) 0,5 мкл Общий объем 20 мкл • Добавьте 20 мкл мастер-микса в каждую пробирку для ПЦР • Добавьте 5 мкл РНК-образца в мастер-микс. Для контрольных реакций используйте 5 мкл без-РНКазной воды для негативного контроля и 5 мкл соответствующей вирусной РНК - для положительного контроля • Запрограммируйте термоциклер в соответствии с условиями термического циклирования • Запустите программу ОТ-ПЦР, при этом пробирки для ПЦР должны еще находиться на льду. Дождитесь, пока термоциклер нагреется до 50оС. Затем поместите пробирки для ПЦР в термоциклер. Условия термического циклирования Обратная транскрипция 30 мин, 50°C Начальная ПЦР-активация 15 мин, 95°C Трехступенчатое циклирование Денатурация 30 сек, 94 °C Отжиг 30 сек, 50 °C Элонгация 1 мин, 72 °C Кол-во циклов 45 Финальная элонгация 10 мин, 72 °C Хранение 4 °C ∞ 3. Агарозный гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР Подготовьте агарозный гель, загрузите продукты ПЦР и маркер молекулярного веса и запустите в соответствии со стандартными протоколами. Визуализируйте наличие маркера под ультрафиолетом. Пример требующегося материала и процедуры приведен ниже Необходимые материалы • Форма для заливки агарозного геля и камера для электрофореза • Источник питания • Трансиллюминатор (λ = 302 nm) • Фотоаппарат и плёнка Polaroid или компьютер, соединённый с камерой • Вариопипетки • 2% агарозный гель в ТАЕ буфере 1 х • 1х ТАЕ буфер • Бромид этидия (10мг/мл) • Буфер для гельэлектрофореза (GLB) 6х • Маркер молекулярного веса Процедура А) Приготовление агарозного геля i) поместите форму с гелем на основу для заливки гелей. Вставьте гребенку и выровняйте основу. ii) приготовьте 2% раствор агарозы путём взвешивания 4 граммов агарозы и разведите в 200 мл 1х ТАЕ буфера. Приготовьте агарозу путём нагревания в микроволновой печи. iii) охладите расплавленую агарозу примерно до 60 °C, затем добавьте 10 мкл бромида этидия. iv) вылейте расплавленную агарозу в форму для заливки геля. v) дайте гелю застыть при комнатной температуре. vi) извлеките гребенку из формы. vii) установите форму в камеру для электрофореза расположив лунками со стороны катодов. viii) заполните камеру для электрофореза 1× TAE до уровня, который закроет гель с верхом. B) Внесение образцов: i) добавьте по 5 мкл буфера для внесения образцов в гель в каждую ПЦР-пробирку. ii) внесите маркер молекулярного веса в первую лунку геля. iii) пипеткой внесите в каждую лунку геля по 15 мкл ПЦР-продукта / буфера для внесения образцов. iv) закройте крышку на камере и присоедините электроды. Проведите гельэлектрофорез в течение 30-35 минут при напряжении 100 вольт. v) с помощью трансиллюминатора визуализируйте присутствие дорожек маркера и ПЦР-продуктов. vi) путём фотосъёмки задокументируйте картинку с гелем. Интерпретация результатов Размер полученных ПЦР-продуктов должен быть сравним с ожидаемым размером. Если тест проходит без использования положительного контроля, полученные продукты необходимо подтвердить путём секвенирования и сравнения с имеющимися последовательностями.
Просмотров: 1108
Холодняк Любовь Владимировна
Хостинг от uCoz@Холодняк Любовь Владимировна