ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА В ЛАБОРАТОРИЯХ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ВИЧ/СПИ - статьи - Каталог статей - Клинико - диагностическая лаборатория
Суббота, 03.12.2016, 15:41
| RSS
Главная | Каталог статей
Меню сайта
Категории раздела
статьи [155]
Нормативные документы Украины [45]
Нормативные документы Казахстана [4]
Накази Мінпраці та соцполітики [3]
Патенты [68]
Нормативные документы Российской Федерации [34]
клінічні протоколи лікування хвороб [19]
авторефераты диссертаций [4]
Нормативные документы Беларуси [21]
Нормативные документы СССР [19]
Полезные ресурсы
Мир лаборатории
Медицинский форум
МедЛабДиагностика
Туберкулез предстательной железы
Каталоги
Яндекс цитирования Рейтинг@Mail.ru
Статистика
Клиническая лабораторная диагностика
Главная » Статьи » статьи

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА В ЛАБОРАТОРИЯХ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ВИЧ/СПИ
Для предупреждения распространения ВИЧ инфекции целесообразно уделять большое внимание качеству диагностики. Точность и надежность результатов проводимых исследований зависят не только от совершенства тест-систем или оборудования в лаборатории, они также обеспечиваются соблюдением всех правил проведения анализа, начиная с момента получения образцов до протоколирования результатов. Формирование системы обеспечения и контроля качества лабораторных исследований – многоэтапный процесс, который требует от работников здравоохранения знаний по его организации и осмысления необходимости создания в каждой лаборатории. Предупредить и устранить возможные ошибки призвана система обеспечения и контроля качества лабораторных исследований, которая должна использоваться каждой диагностической лабораторией и быть адекватна проводимым лабораторным исследованиям. Цель данных практических рекомендаций заключается в описании приготовления контрольных образцов для внутреннего контроля качества при постановке иммуноферментного анализа, методов оценки погрешностей и методов выявления, устранения и предотвращения основных источников ошибок. Д.м.н. профессор Маткаримов Б.Д. 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ Принцип внутреннего контроля качества (ВКК) достаточно прост: при каждой постановке анализа вместе с образцами пациентов необходимо проводить измерение одного и того же контрольного материала, а результаты этих измерений заносить в контрольную карту. Рекомендации, приведенные в данной главе, помогут вам самостоятельно приготовить внутрилабораторные контрольные образцы (КО). 1.1. Биологический материал. В зависимости от поставленных задач или определяемого маркера, объектом серологических исследований могут оказаться самые различные биологические субстанции: цельная кровь, сыворотка, плазма, моча, слюна, цервикальная жидкость и др. Однако поскольку большинство коммерческих диагностикумов, используемых в медицинских лабораториях, разработаны для исследований сыворотки и/или плазмы, последующие главы будут касаться именно этих биологических материалов. Так как плазма имеет тенденцию быть неустойчивой при хранении и может самопроизвольно свертываться (особенно после замораживания или оттаивания), для приготовления КО более предпочтительно использовать сыворотку. Контрольные образцы должны тестироваться при каждой постановке анализа. Поэтому минимальный объем материала, который требуется для полной характеристики и приготовления каждой сотни образцов, должен составить примерно 30 мл. Если такой объем сыворотки недоступен, можно использовать рекальцифицированную плазму. 1.2. Конверсия плазмы в сыворотку. Рекальцификация - небезопасная и технически сложная операция, которую следует выполнять в боксе, с соблюдением всех правил работы с патогенным биоматериалом I-II группы. • Приготовьте раствор СаС12«2Н2О с концентрацией 2 мол/литр. Для этого растворите 3 г СаС12.2Н2О в 10 мл дистиллированной воды. • Добавьте 0,5 мл свежеприготовленного раствора CaCI2 к 100 мл плазмы, перемешайте и выдержите на водяной бане при 37 °С в течении 1 часа. Для коагуляции больших объемов может потребоваться 2-3 часа. • Если плазма не свернулась, то можно добавить еще 0,25 мл CaCI2 (на 100 мл плазмы) и продолжить инкубацию. • Когда плазма свернулась, достаньте ее из водяной бани, охладите, поставьте флакон и поместите в морозильную камеру, желательно при температуре ниже минус 20 °С на всю ночь. • Во время замораживания и размораживания плазмы необходимо использовать флаконы из термоустойчивого стекла. • Достаньте флакон из морозильной камеры, дайте растаять при комнатной температуре и отделите сыворотку от фибринового сгустка. Для малых объемов при использовании пакетов для сбора разделение можно выполнить с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут. 1.3. Контрольные образцы. Для наиболее надежного контроля качества выполняемых исследований можно использовать сразу 2 или 3 контрольных образца Например: сыворотка, содержащая антитела к ВИЧ 1; сыворотка, содержащая антитела к ВИЧ 2; и сыворотка, не содержащая эти маркеры. Главным требованием предъявляемым к контрольным образцам является их способность идентифицировать любые изменения в измерительной системе, которые способны повлиять на конечные результаты анализа. Поэтому предпочтительнее использовать контрольные образцы, чья оптическая плотность в ИФА близка к границе между положительными и отрицательными результатами (ОП крит.). Оптимальный контроль чувствительности и специфичности может быть достигнут при использовании положительных и отрицательных контрольных образцов с оптической плотностью в 1,5 раза выше или, соответственно, ниже величины ОП крит. Приведенная ниже схема создания контрольных образцов с низким содержанием анти-ВИЧ может быть служить примером для приготовления любых других серологических контрольных образцов. 3.1.1.Приготовление контрольных образцов, содержащих анти-ВИЧ. КО с оптической плотностью близкой к ОП крит. можно приготовить путем разведения сыворотки с высоким титром анти-ВИЧ другой сывороткой, не содержащей анти-ВИЧ. Материалы необходимые для приготовления КО: • 1-2 мл анти-ВИЧ положительной сыворотки • Около 40 мл анти-ВИЧ отрицательной сыворотки • Откалиброванные автоматические дозаторы с регулируемым объемом • Новые наконечники для автоматических дозаторов • Конические центрифужные пробирки • Стеклянный мерный стакан на 50 мл • Качественная ИФА тест-система, рекомендованная к использованию национальными органами контроля качества (Главное управление контроля качества лекарственных средств и медицинской техники МЗ РУз, Референс лаборатория МЗ РУз) или международной организацией (ежегодный доклад ВОЗ "HIV assay kits. Operational characteristics"), a также все необходимое для постановки иммуноферментного анализа. • Пластиковые пробирки с крышкой типа "Cryovials" или "Ependorf" На рис. 1 приведена общая схема разведений на первичной стадии приготовления КО - стадии поиска необходимого разведения и т.д. до разведений 1/64; 1/256; 1/1024; Для того, чтобы получить разведения 1/32 или 1/128 к 100 мкл сыворотки 1/16 или 1/64 добавьте 100 мкл отрицательной сыворотки. После того как Вы выбрали разведение, при котором оптическая плотность при постановке иммуноферментного анализа примерно в 1,5 раз выше ОП крит, необходимо приготовить его в количестве достаточном как минимум для 100 постановок (=30 мл). Рекомендуем это делать также поэтапно. Пример приготовления 32 мл сыворотки «1/128»: Рис. 2 Схема разведений. К 0,25 мл (250 мкл) анти-ВИЧ положительной сыворотки добавить 0,75 мл (750 мкл) анти-ВИЧ-отрицательной сыворотки. Тщательно перемешать (20-30 раз). К приготовленной сыворотке добавить еще 7 мл анти-ВИЧ-отрицательной сыворотки. Тщательно перемешать (20-30 раз). Полученные 8 мл разведенной анти-ВИЧ положительной сыворотки развести в 24 мл анти-ВИЧ-отрицательной сыворотки и опять тщательно перемешать. Если же сразу разводить 0,25 мл цельной анти-ВИЧ-положительной сыворотки в 31,75 мл отрицательной сыворотки, то вероятнее всего произойдет неравномерное распределение антител и в одних пробах их концентрация окажется выше, а в других, соответственно, ниже. 3.1.2 Хранение. Во избежание повторного замораживания и оттаивания, которые могут привести к деградации антител, полученную сыворотку следует разлить в пластиковые пробирки с закручивающееся крышкой по 200 - 300 мкл (объем достаточный для одной постановки анализа). Образцы должны храниться при температуре от минус 20 °С. 2. Методы оценки погрешностей 2.1. Создание контрольных карт Для повседневного контроля серологических тестов возможно использовать метод контрольных карт Леви-Дженнингса. 1. Приготовленные контрольные образцы нужно измерять так же, как и обычные сыворотки, через каждые 20-40 проб пациентов. 2. Определить в каждой постановке величину X = ОП/ОП крит 3. После того, как Вы 20 раз определили величину X, найдите среднее арифметическое значение Хср. Хср = Х,+Х2+Х3 +...+Х20 / 20 4. Рассчитайте стандартное отклонение (5 или SD). Согласно формуле: 5. Определите предупредительные границы: Хср - 25 и Хср + 25 6. Определите контрольные границы карты: Хср - 35, Хср + 35 В данном случае, 5 будет равна: 7. Постройте карту (Рис. 3), нанеся Хср в качестве центральной линии карты и параллельно ей две предупредительные {Хср ± 25) и две контрольные границы {Хср + 35), и начинайте работать, отмечая на карте день постановки и величину ОП контрольных образцов. 8. Если после построения карты один результат будет находиться за предупредительными границами (Рис. 2), необходимо исключить данный результат из расчетов и заново пересчитать величину 5 по оставшимся 19 результатам, которая будет равна: 9. Если после построения карты сразу несколько результатов будут находиться за пределами Хcр ± 25, необходимо приостановить анализы и принять меры для выявления и исключения ошибок. 2.2. Оценка контрольных карт. Оценка контрольных карт может осуществляться согласно правилам Вестгарда, представленным в следующей таблице: Шесть наиболее важных правил Вестгарда (Westguard's rules). Правило Определение Тип ошибки 12SD Один контрольный результат вышел за пределы Хcр ± 25 Случайная 13SD Один контрольный результат вышел за пределы Хcр ± 35 Случайная R4SD Разница между максимальным и минимальными контрольным результатами превышает 45 Случайная 22SD Два последовательных измерения вышли за пределы Хcр - 25 или Хcр + 25 Систематическая 41SD Четыре последовательных измерения вышли за пределы Хcр -15 или Хcр + 15 Систематическая 10х Десять последовательных измерений лежат по одну сторону от средней линии (Хcp) Систематическая 2.3 Примеры использования правил Вестгарда Рис. 4. Правило «опасности» или сигнальный критерий: полученное значение больше, чем +25 или -25. Если это происходит только на одном уровне в течение одного дня, то это можно рассматривать только как предупреждение. 3. ОСНОВНЫЕ ИСТОЧНИКИ ОШИБОК (выявление, устранение и предотвращение) 3.1. Случайные ошибки 3.1.1. Постановка анализа. Важно помнить, что гарантия качества серологических исследований заключается в соблюдении всех обычных условий проведения анализа. Тем не менее, ниже приводятся некоторые правила, которые обычно не упоминаются в инструкциях, однако несоблюдение, которых может оказаться причиной ошибочных результатов. • Продолжительность этапа внесения образцов сывороток и реагентов в лунку, где будет происходить реакция, не должна превышать 30% времени последующей инкубации; • Нельзя отбирать внесенную по ошибке сыворотку из лунки с целью внесения туда другой сыворотки; • Необходимо чтобы показания термометра в термостате точно соответствовали температуре на полке, где происходит инкубирование реакционной смеси; • Рекомендуется регистрировать показания термометра перед каждой постановкой анализа; • Строго соблюдать продолжительность всех этапов постановки анализа, указанную в инструкции по применению; • Температура в лаборатории должна составлять 20-25 °С. 3.1.2. Регистрация результатов. Как показывает практика, ошибочные результаты подчас возникают на стадии регистрации результатов. Причиной ошибок может оказаться соринка, попавшая в лунку, запотевшее дно плашки для иммуноферментного анализа или «дефект пластика», из которого изготовлена эта плашка. Поэтому настоятельно рекомендуется: • Соблюдать все условия регистрации, указанные в инструкциях по применению тест-систем (наличие контроля коньюгата, вычитание влияния абсорбции с помощью дополнительной регистрации при длине волны 620 нм, использование соответствующих светофильтров); • Перед учетом результатов с помощью спектрофотометра протирать дно плашек мягкой не ворсистой тканью; • Всегда сравнивать показания, выданные аппаратом с визуально наблюдаемым окрашиванием в лунках; • Отмечайте лунки с дефектом; 3.1.3. Выбор и хранение тест-систем. При выборе тест-систем и их хранении необходимо руководствоваться следующими правилами: 1. Тест-системы должны быть зарегистрированы Главным Управлением по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники (ГУККЛСМТ) МЗ РУз. Предпочтение следует отдавать тест-системам, рекомендованным к использованию национальными органами контроля качества (ГУККЛСМТ, Референс лаборатория МЗ РУз) и/или международными организациями (ежегодный доклад ВОЗ "HIV assay kits. Operational characteristics"). 2. Тест-системы должны закупаться у официальных дистрибьюторов, имеющих соответствующий сертификат и регистрационное удостоверение; 3. Тест-системы должны быть использованы до окончания срока хранения, который обязательно должен быть указан производителем на упаковке. В первую очередь следует использовать тест-системы с наиболее близким к окончанию сроком хранения. 4. Тест-системы должны храниться при соответствующей температуре, указанной в инструкции по применению. 5. Ответственность за прием и хранение тест-систем должна быть возложена на подготовленного лабораторного специалиста. 6. В лаборатории должны быть разработаны соответствующие инструкции по транспортировке, хранению и утилизации тест-систем. 7. Нельзя перекладывать содержимое тест-систем из одной коробки в другую или компоновать тест-систему из нескольких наборов. 3.1.4. Оценка профессиональных навыков персонала. В лаборатории должны быть установлены процедуры, позволяющие оценивать профессиональный уровень персонала. Такие процедуры лаборатории могут разрабатывать самостоятельно, однако, для обеспечения объективности результатов данные процедуры должны отвечать следующим требованиям: • Процедуры должны проводиться в стандартных условиях, детально описанных в соответствующей инструкции. • Результаты должны регистрироваться с помощью соответствующего измерительного оборудования и выражаться в определенных единицах (т.е. мг, ОП, мл, ОП/ОП крит и т.п.) • Анализ результатов должен быть основан на методах статистики. Примером такой процедуры может служить принятый в Референс лаборатории МЗ РУз метод оценки навыка работы с автоматическим дозатором. 3.1.5. Оценка навыка работы с автоматическим дозатором. Осуществление данной процедуры требует уже функционирующего в лаборатории внутреннего контроля качества. • Во время повседневной постановки иммуноферментного анализа испытуемый сотрудник вносит в один из стрипов восемь используемых в лаборатории контрольных образцов (см. главу "Приготовление контрольных образцов"). • Данные, полученные при измерении этих образцов, вносятся в уже построенную Вами контрольную карту, (см. главу "Методы оценки погрешностей"). • Если в результате установлена погрешность, соответствующая любому из правил: 12sd, I3SD или 4SD, врач-лаборант информируется о необходимости улучшения навыков при работе с автоматическими дозаторами. 3.2. Систематические ошибки. Наиболее вероятным источником систематической ошибки в проводимых измерениях считается лабораторное оборудование. Применительно к ИФА-диагностике, при появлении систематической ошибки обычно рекомендуется: 1. провести калибровку автоматических пипеток; 2. проверить состояние спектрофотометра (мультискана, унискана); 3. проверить работу термостата; 3.2.1. Термостат Для проверки работы термостата достаточно поместить на полке (где лежит плашка) дополнительный контрольный термометр. При наличии разницы, термостат следует перенастроить по контрольному термометру. 3.2.2 Спектрофотометр Техническое обслуживание спектрофотометра требует наличия специальных знаний. Поэтому наиболее правильным шагом, в данном случае, будет привлечение специалиста. Вместе с тем, для спектрофотометра (такого, например, как распространенный в нашей стране унискан фирмы «Bio-Tek») со светофильтрами вставляемыми снаружи, а стало быть контактирующими с пылью, влагой или даже пальцами лаборантов, рекомендуется регулярно протирать линзы светофильтров фланелью, смоченную эфиром. Если же светофильтры находятся внутри аппарата, эта операция является излишней. 3.2.3 Калибровка автоматических пипеток. Периодичность. Пипетки должны проверятся 1 раз в полгода или каждый раз, когда качество проводимых исследований оказывается не удовлетворительным. Тип пипеток. Пипетки с фиксированным объемом калибруются по заданному объему. Пипетки с регулируемым объемом калибруются по двум точкам: по минимальному и максимальному объемам пипетки. Например, чтобы оценить состояние пипетки объемом 20-200 мкл, необходимо установить насколько точно она «набирает» 20 мкл и насколько точно она «набирает» 200 мкл. Материалы. • весы аналитические • термометр • вода дистиллированная • новые чистые наконечники • чистые пенициллиновые флаконы • протоколы калибровки Методика (упрощенная). Измерьте температуру воды, определите по таблице 1 коэффициент Wt. Занесите данные в формуляр. Проверяйте температуру через каждые 2 часа Отметьте в формуляре емкость и номер пипетки Поставьте пенициллиновый флакон на весы Уравновесьте весы Если пипетка с регулируемым объемом, то установите минимальное значение объема. Вычисления. Наберите воду пипеткой и слейте ее во флакон, стоящий на весах. Отметьте вес в формуляре Уравновесьте весы. Опять наберите воду и измерьте ее вес. Общее количество измерений - 6 раз. Если пипетка с регулируемым объемом, то установите максимальное значение объема и повторите процедуру. 1. Определите средний вес: mср = (m1 + m2 + m3 + m4 +m5 + m6 ) / 6 2. Определите емкость пипетки: Cm = mср х Wt) 3. Определите процент погрешности, которую делает пипетка относительно номинального объема Сn: Е = (Сm-Сn) х 100/Сn 4. Допустимая погрешность: ± 5 % для пипеток объемом 1 - 50 мкл ± 3 % для пипеток объемом > 50 мкл 5. Если погрешность превышает указанные пределы, то следует ее отрегулировать и повторить процедуру калибровки. Данные калибровки заносятся в специальные формуляры,
Просмотров: 4377
Холодняк Любовь Владимировна
Хостинг от uCoz@Холодняк Любовь Владимировна